Grüne Gentechnologie

Die genetische Modifikation von Pflanzen setzt zunächst Kenntnisse über die gewünschten Merkmale voraus, wie beispielsweise Resistenzen gegenüber Schädlingen, Stoffwechselabläufe etc.. Ein Merkmal muss einem Ort auf dem Erbgut des künftigen ‚Spenderorganismus’ zugeordnet werden. Die genetische Zusammensetzung (Sequenz) des Merkmals wird ermittelt, die entsprechenden DNA-Abschnitte isoliert, manipuliert und in den ‚Empfängerorganismus’ eingebracht (Gentransfer). Grundlagen des Transfers sind im Grunde natürliche Abläufe. Am Beispiel des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens wird deutlich, dass auch innerhalb der Natur der Transfer von Genen stattfindet. Agrobacterium tumefaciens ist ein im Boden lebendes Bakterium. Es besitzt ein sogenanntes Tumor induzierendes (Ti)-Plasmid. Auf dem Ti-Plasmid sind unter anderem Gene zur Bildung von speziellen chemischen Verbindungen (Opinen) lokalisiert, welche eine Nahrungsquelle für das Bakterium darstellen. Tritt eine Verwundung am Wurzelhals der Pflanze auf, so kann Agrobacterium tumefaciens an diese Zellen binden. Dabei überträgt es den mobilen Teil des Ti-Plasmides, seine Transfer (T)-DNA. Es hat eine Transformation von genetischem Material stattgefunden.

Die T-DNA wird in das Pflanzengenom eingebaut. Während der Zellteilung wird das gesamte Genom kopiert und an die Tochterzellen weitergegeben. Damit besitzen nun auch die Tochterzellen die Bereiche der T-DNA. 
Auf der T-DNA befinden sich zusätzlich Abschnitte, die ein ungeregeltes Zellwachstum bei der Pflanze auslösen. Es bildet sich am Wurzelhals der Pflanze eine Wucherung aus. In diesen Zellen werden nun die für die Bakterien wichtigen Opine gebildet. Auf diese Weise schafft sich das Bakterium eine Nahrungsquelle.

Innerhalb der Gentechnologie existieren eine Vielzahl von verschiedenen Methoden, um Gentransfer zu ermöglichen. Dabei wird zwischen dem direkten und dem indirekten Gentransfer unterschieden.

Direkter Gentransfer

Der direkte Gentransfer findet immer dann statt, wenn DNA-Abschnitte direkt, ohne zu Hilfenahme eines Vektors in die Zellen oder in das Gewebe von Pflanzen eingebracht werden. Dazu gehört unter anderem der direkte Gentransfer in Protoplasten, die Mikroinjektion und die Partikelbeschusstechnik.

Direkter Gentransfer in Protoplasten

Protoplasten sind Zellen ohne Zellwände, deren einzige Barriere nach außen die Zellmembran darstellt. Für das Einbringen des gewünschten Materials in die Protoplasten muss diese letzte Barriere überwunden werden. Dies geschieht durch

  1. Detergenzien
  2. Elektroporation
  3. Liposomen

Detergenzien

Da Nukleinsäuren und Zellmembran negativ geladen sind, fällt den Detergenzien die Aufgabe zu, mit positiv geladenen divalenten Kationen zwischen beiden Parteien zu vermitteln und beide in einen möglichst engen Kontakt zu bringen. Mit weiteren Detergenzien wird die Zellmembran dazu gebracht, sich einzustülpen und dadurch die Nukleinsäuren aufzunehmen. 

Elektroporation

Die Elektroporation ist dagegen eine physikalische Methode zur Steigerung der DNA-Aufnahme in lebende Zellen. Sie basiert auf der Beobachtung, dass die Durchlässigkeit von Biomembranen kurzfristig durch elektrische Pulse erhöht werden kann, ohne die Membranstrukturen nachhaltig zu zerstören. Dadurch kann ein kurzfristiger Stoffaustausch erfolgen, der auch zum Einschleusen von Makromolekülen wie DNA und RNA genutzt wird. 

Liposomen

Nukleinsäuren können auch in Liposomen verpackt in die Protoplasten eingebracht werden. Membranen sind einheitlich aufgebaut. Sie bestehen aus Phospholipiden mit einem hydrophilen (dem Wasser zugewandt) und hydrophoben (dem Wasser abgewandt) Anteil. In der Regel lagern sich die hydrophoben Teile zu einer Doppelschicht zusammen, während die hydrophilen Teile nach außen weisen, hin zum wässrigen Milieu. Durch verschiedene Methoden lassen sich Nukleinsäuren in Liposome verpacken. Die Nukleinsäuren gelangen über Verschmelzen der Liposomen mit der Zellmembran oder kompletter Aufnahme der Liposomen in das Innere des Protoplasten. 

Eine andere Methode ist in diesem Zusammenhang das Binden der DNA an Liposomen als Transportmittel. Diese können ohne zusätzliche Hilfe mit der Zellmembran verschmelzen.

Indirekter Gentransfer

Der indirekte Gentransfer verwendet zur Übertragung von DNA-Abschnitten einen Vektor als Überträger der Information. Als Vektor können Viren und Bakterien fungieren. Die DNA-Abschnitte werden in den gewünschten Vektor eingebracht. Dieser sorgt im Folgenden dafür, dass die genetische Information in die Pflanzenzelle überführt wird.

Veränderungen

Die grüne Gentechnologie leistet zum einen ihren Beitrag im wissenschaftlichen Bereich, wie das Erforschen von Genstruktur und deren Regulation in der Pflanze, zum anderen werden anwendungsbezogene Interessen beachtet, wie das Einbringen von Toleranzen/Resistenzen und die Qualitätssteigerung von Kulturpflanzen. In diesem Rahmen soll auf die anwendungsbezogenen Interessen eingegangen werden.

  • Herbizidtoleranz
  • Insektentoleranz
  • Virusresistenz
  • Pilzresistenz
  • Inhaltsstoffe und Qualitätssteigerung

Herbizidtoleranz

Herbizide weisen unterschiedliche Umweltverträglichkeiten auf. Die seit 1980 eingeführten Total-Herbizide zeigen eine entschieden bessere Umweltverträglichkeit im Vergleich zu selektiv wirkenden Herbiziden. Sie werden rascher abgebaut und besitzen eine kürzere Verweildauer im Boden. Allerdings wirken Total-Herbizide nicht selektiv gegen bestimmte Unkräuter, sondern schädigen auch Kulturpflanzen. Sie sind daher nur begrenzt einsetzbar. Um dies zu umgehen, wurde mit der Züchtung von herbizidtoleranten Kultursorten begonnen, auf konventionellem Weg wie auch mit Mitteln der Gentechnik. Mit Hilfe der Gentechnik werden Gene in die Pflanzen übertragen, welche die Pflanze dazu befähigen ein bestimmtes Herbizid zu tolerieren Ein Beispiel hierfür ist der Wirkstoff Phosphinothricin, eine von dem Bodenbakterium Streptomyces viridochomogenes gebildete Aminosäure. Der synthetisch hergestellte Wirkstoff trägt die Bezeichnung Glufosinat und wird als Bestandteil eines Total-Herbizides eingesetzt. Glufosinat bewirkt die Hemmung eines Schlüsselenzyms der Pflanze, die Glutamin-Synthetase. Die Glutamin-Synthetase bewirkt im Stickstoff-Stoffwechsel die Entgiftung von Ammoniak. Wird diese Entgiftung unterbrochen oder gehemmt, so werden die Pflanzenzellen geschädigt, die Pflanze stirbt ab. Die Toleranz gegen dieses Total-Herbizid wird durch eine Übertragung des Gens aus dem Bodenbakterium Streptomyces viridochomogenes erreicht. Dieses Gen bewirkt in der Pflanze die Bildung eines Enzyms, PAT (Phosphinothricin-Acetyl-Transferase), welches das Herbizid abfängt und in ein unschädliches Produkt umwandelt. 

Die Anzahl der Anträge zur Freisetzung von gentechnisch veränderten Pflanzen auf dem Gebiet der Herbizidtoleranz zeigt die Priorität dieses Themas. Die Herbizidtoleranz lag mit 1138 Freisetzungsanträgen von 1789 Gesamtanträgen im Zeitraum von 1990-2001 vor anderen Interessengebieten wie die Veränderungen des Metabolismus mit 365 Anträgen und Insektenresistenzen mit 275 Anträgen (Quelle: BBA Braunschweig). In Deutschland laufen zur Zeit 2 Anträge auf Freisetzung von gentechnisch verändertem Raps, der eine Toleranz gegenüber Herbiziden mit dem Wirkstoff Phosphinothricin besitzt.

Durch die Gentechnik können Pflanzen über drei verschiedene Ansätze vor der Wirkung von Herbiziden geschützt werden:

  • Erhöhung der Konzentration des durch das Herbizid gefährdeten Enzyms
  • Veränderung des Enzyms, so dass es seine Funktion innerhalb der Zelle ausüben kann, dennoch das Herbizid nicht gebunden wird. Somit kann das Herbizid seine Wirkung nicht entfalten.
  • Einbringen von Genen für die Herbizidtoleranz

Insektentoleranz

Im Laufe der Evolution haben Pflanzen Abwehrmechanismen gegenüber Insekten erworben. Ziel ist es, diese Mechanismen zu nutzen oder neue Resistenzen zu finden und sie in sensitive Pflanzen einzubringen. 

Der am häufigsten verwendete Ansatz ist die Übertragung von Genen des Toxins von Bacillus thuringiensis (Bt-Toxine). Es wurden bislang 275 Freisetzungen im Bereich der Insektentoleranz beantragt (Quelle: BBA). Davon beruhte die eingebrachte Resistenz bei 216 Anträgen auf Bt-Toxinen. Präparate von Bacillus thuringiensis werden schon seit mehr als 30 Jahren zur Schädlingsbekämpfung eingesetzt. Bacillus thuringiensis bildet im Laufe seiner Vermehrung ein für bestimmte Insekten giftiges Protein (Endotoxin). Das Endotoxin wird normalerweise im Bakterium in einer inaktiven Form als Kristall abgelagert. In der Landwirtschaft wird das Bakterium selbst, bzw. die von ihm produzierten Endotoxine auf die Kulturflächen aufgetragen. Von den Schadinsekten wird das Endotoxin durch Fressen aufgenommen. Im Darm der Insekten verändert sich das Endotoxin chemisch in seine aktive Form und tötet das Insekt. 

Nachteile der direkten Applikation von Bakterium oder Toxin stellen die hohen Kosten industrieller Präparate, ihre geringe Stabilität, die eine mehrmalige Wiederholung der Applikation erforderlich macht und die mangelhafte Breitenwirkung dar. Dazu kommt, dass nichts über den Einfluss der in hoher Konzentration vorgenommenen Applikation des Bakteriums auf das Bodenökosystem bekannt ist. 

Insektenresistente Baumwolle ist seit 1996 in den USA im Anbau. Diese Baumwolle enthält ein aus Bacillus thuringiensis, subsp. kurstaki (B.t.k.) isoliertes Gen. Die transgenen Baumwollpflanzen produzieren ein Endotoxin, das spezifisch gegen die Schädlinge Cotton Bollworm und Tobacco Budworm wirkt. Dadurch konnten bereits 2 Jahre nach dem ersten Anbau rund 1.000 Tonnen weniger Insektizide verwendet werden im Vergleich zum Jahr 1995.

Ein weiterer Ansatz in der Resistenzzüchtung liegt in der Isolierung von Genen für die Bildung von Enzyminhibitoren und Lektinen. Es wurden bereits Proteaseninhibitoren identifiziert, die hauptsächlich oder ausschließlich im Darmtrakt von Insekten enthaltene Proteasen hemmen und somit eine toxische Wirkung auf den Schadorganismus ausüben. So wurde beispielsweise Blumenkohlpflanzen mit Trypsin-Inhibitor-Genen transformiert zum Schutz gegen Schadinsekten. Die Gene des Trypsin-Inhibitors stammten aus der Süßkartoffel und ermöglichen den Blumenkohlpflanzen ein Leben mit den für sie normalerweise schädlichen Insekten (DING et al. 1998).

Virusresistenz

Viruserkrankungen bei Pflanzen stehen keine geeigneten Bekämpfungsmaßnahmen gegenüber. Die Bekämpfung von Viren war bislang nur auf indirektem Weg möglich durch die Notwendigkeit einer Verbesserung der Kulturhygiene, Fruchtwechsel, Saatgutbehandlung oder komplette Rodung der Fläche (Weinbau). Chemisch ist nur ein indirekter Pflanzenschutz über das Spritzen gegen virusübertragende Insekten möglich. Über konventionelle Züchtung konnten zwar bei vielen Kulturpflanzen Virusresistenzen eingekreuzt werden, allerdings führen Virusinfektionen immer noch zu erheblichen Ernteverlusten. Hier bildet die Gentechnik eine echte Alternative zu dem herkömmlichen Pflanzenschutz. Derzeitig liegen der BBA 139 Freisetzungsanträge bezüglich Virusresistenz vor. Dabei sind hauptsächlich die Kulturen Zuckerrübe, Kartoffel und Tomate betroffen. Es wird an verschiedenen Ansätzen zur Erzeugung von Virusresistenzen gearbeitet, z.B.:

  • Erzeugung von Präimmunität über Virus-Hüllproteine
  • Anti-Sense-Technik
  • Ribozyme
  • RNA abhängige RNA-Polymerase
  • Resistenz durch die Bildung defekter Transportproteine
  • Satelliten RNA
  • Antivirale Proteine
Erzeugung von Präimmunität über Virus-Hüllproteine

Dieser Methode liegt die Beobachtung von McKinney 1929 zugrunde, dass Tabakpflanzen resistent waren gegenüber einem aggressivem Stamm des Tabak-Mosaik-Virus, wenn die Pflanzen vorher mit einem schwächeren Stamm infiziert wurden. Dementsprechend wurden Gene für die Hüllproteine von Viren in Pflanzen eingebracht. Die transgenen Pflanzen produzieren nun selber das Hüllprotein und täuschen damit eine Virusinfektion vor. Die Infizierung mit einem tatsächlich Virus wird darüber abgemildert. Diese Methode liefert allerdings keine vollständige Resistenz, sondern die nachfolgende Reaktion auf eine tatsächliche Virusinfektion ist von dem Virustyp und dem viralen Transgen abhängig. Es findet sich eine ganze Reihe an verschiedenen Reaktionen. So korreliert für das Tabakmosaikvirus beispielsweise der Grad der Resistenz mit der Konzentration an Hüllproteinen, die in der Pflanze gebildet werden. Für andere Viren besteht ein solcher Zusammenhang nicht, oder es existiert eine starke Resistenz der transgenen Pflanzen ohne den Nachweis des Hüllproteins.

Anti-Sense-Technik

Die Anti-Sense-Technik beruht darauf, dass die meisten phytopathogenen Viren RNA als Erbsubstanz enthalten. Diese wird nach Eindringen in die pflanzliche Zelle aus dem Hüllprotein freigesetzt. Die einzelsträngige RNA ist Voraussetzung für die Vermehrung des Virus innerhalb der Pflanzenzelle. Die Bildung eines zweiten, zur Virus-RNA komplementären RNA (Antisense-RNA)-Stranges durch die Pflanze, bewirkt eine Bindung der beiden RNA-Stränge zu einem Doppelstrang. Damit wird die virale RNA der weiteren Virus-Synthese entzogen. Es kommt zu keiner Vermehrung des Virus innerhalb der Pflanze.

Ribozyme

Ribozyme sind enzymatisch wirksame Ribonukleinsäuren. In Pflanzen, welche durch Gentransfer Ribozyme produzieren, wird das Virus gezielt durch diese gespalten, bevor es sich vermehren kann. Dies setzt allerdings eine hohe Konzentration an Ribozym in der Pflanzenzelle voraus.

RNA abhängige RNA-Polymerase

Die hier vermittelte Resistenz erfolgt durch die Einführung des Gens für die RNA abhängige RNA-Polymerase. Der genaue Reaktionsmechanimus, der die Resistenz auslöst, ist allerdings noch unklar.

Resistenz durch die Bildung defekter Transportproteine

Viren werden innerhalb einer Pflanze durch spezielle Transportproteine weitergeleitet. Das Virus überträgt zusammen mit seinem Erbmaterial die Gene zur Bildung der Transportproteine. Die Pflanze produziert jetzt selbst diese Proteine. Es ist möglich, Gene für modifizierte nicht voll funktionstüchtige Transportproteine in die Pflanzen zu übertragen. Dies führt dazu, dass die veräderten Proteine ihrer ursprünglichen Funktion nicht mehr nachkommen können. Das Virus kann sich aufgrund dessen nicht ausbreiten. Ein Beispiel hierfür ist das Blattrollvirus bei der Kartoffel. Hier besitzt das Transportprotein zwei Bindungsstellen, eine zur Bildung eines Komplexes der Transportproteinmoleküle, die zweite Bindungsstelle dient der Bindung der Virus-RNA. Die Virus-RNA wird durch das Protein in eine langgestreckte Form überführt. Nur in dieser Form kann die RNA von Zelle zu Zelle durch die Poren weitergegeben werden. Das modifizierte Transportprotein kann diese Funktion nicht mehr ausführen und das Virus bleibt auf die infizierte Zelle begrenzt.

Satelliten RNA

Innerhalb von Viren tritt Satelliten-RNA auf. Dies sind RNA-Abschnitte, die außerhalb der normalen Virus-RNA liegen. In Pflanzen eingebrachte satRNA können im Falle einer Virusinfektion die Reaktion der Pflanze abschwächen oder verstärken. Erklärungsversuche gehen davon aus, dass die satRNA mit der viralen RNA um die RNA abhängige RNA-Polymerase konkurriert. Allerdings ist der Schutz transgener Pflanzen aufgrund von eingebrachter viraler satRNA ein wenig verstandener Prozess.

Antivirale Proteine

Diese Methode beruht darauf, dass Ribosomen-inaktivierende Proteine in der Pflanzenzelle gebildet werden. Die Ribosomen einer Zelle sind an der Bildung von Eiweißen beteiligt. Die Hemmung der Ribosome führt daher zum Absterben der Zelle. Die Vermehrung eines Virus ist damit verhindert. Zwar weisen antivirale Proteine ein breites Wirkungsspektrum auf, aber die Pflanzen, die entsprechende Konzentrationen dieser Proteine bildeten, waren in ihrem Wuchs nicht normal.

Pilzresistenz

Pflanzen wehren sich gegen Schadorganismen beispielsweise durch besonders ausgestattete Blattoberflächen und erhöhte Verholzung der Zellwände. Diese Abwehrmechanismen können durch die Schadorganismen selber oder durch Chemikalien, Umweltsituationen etc. ausgelöst werden. Spezielle Enzyme, Chitinasen, die in Pflanzensamen enthalten sind erfüllen ebenfalls eine Abwehrfunktion. Chitinasen spalten Chitin und schützen so die Samen vor eindringenden Pilzhyphen. Chitin selber ist für den Aufbau pilzlicher Zellwände verantwortlich. Mit ß-1,3-Glucanasen zur Spaltung des in den pilzlichen Zellwänden vorkommenden Glucans schützen sich Pflanzen ebenfalls gegen Pilzbefall. Zudem treten in der Pflanze Proteinase-Inhibitoren, sowie toxische Proteine auf.

Andere Pflanzen sind von Natur aus mit eigenen Fungiziden ausgestattet, welche nach einer Pilzinfektion synthetisiert werden. Resveratrol, ein Phytoalexin, gehört zu den pflanzeneigenen Abwehrstoffen und wird von dem Enzym Stilbensynthase aufgebaut. Zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit von Pflanzen gegenüber von Pilzbefall werden unter anderem die Übertragung pflanzlicher Gene vorgenommen, die in bestimmten Pflanzenarten vor Pilzbefall schützen. Ein Beispiel hierfür ist die in Deutschland erfolgte Übertragung von Gene für Chitinasen, Glucanasen und RIP (Ribosominaktivierendes Protein) zur Erhöhung der Widerstandsfähigkeit von Weinreben gegenüber Falschem und Echtem Mehltau (Bundesanstalt für Züchtungsforschung an Kulturpflanzen, Quedlinburg; Bundesanstalt für Rebenzüchtung Geilweilerhof). Seit 1999 befinden sich diese transgenen Rebenpflanzen im Freilandversuch. Ein weiteres Beispiel ist die Transformation des Stilbensynthase-Gens in Weizen und Gerste zur Bildung des Phytoalexins Resveratrol (LECKBAND et al. 1998).

Des Weiteren wird versucht, über die Übertragung bakterieller Gene gegen Pilzbefall eine Erhöhung der Widerstandsfähigkeit zu erreichen. Hierzu zählt die Übertragung von Genen der Chloroperoxidase (CPO-P) aus dem Bakterium Pseudomonas pyrrocinia in Tabak. Transformierte Tabakpflanzen wiesen eine wesentlich erhöhte Resistenz gegenüber den Pilzen Aspergillus flavus und Colletotrichum destructivum auf (RAJASEKARAN et al. 2000).

Inhaltsstoffe und Qualitätssteigerung

Pflanzen können gentechnisch so verändert werden, dass sie bestimmte Inhaltsstoffe produzieren. Dazu zählt beispielsweise die Produktion von Vitaminen, wie der Provitamin A bildende “Golden Rice”, sowie bestimmte, industriell nutzbare Rohstoffe, wie die in ihrer Stärkezusammensetzung geänderte Kartoffel (Kleister, Papierindustrie, Seifen, etc.) oder der gentechnisch veränderte Raps zur Produktion von vielfach ungesättigten Fettsäuren (Wachsherstellung). Die Produktion von pharmazeutisch verwertbaren Stoffen (z. B. Impfstoffe) in der Pflanze ist ein weiterer Bereich. Dabei wird unterschieden, ob der spätere Impfstoff direkt über den Verzehr der transgenen Pflanze appliziert wird, oder ob der Impfstoff später aus der Pflanze isoliert und weiterverarbeitet werden soll. Erste Versuche beschäftigen sich mit der Herstellung von Impfstoffen gegen z. B. Hepatitis B Virus, Cholera Virus, Tollwutvirus. Durch die übertragene Toleranz bzw. Resistenz werden transgene Pflanzen nicht nur vor dem entsprechenden Schädling geschützt, sondern auch vor einer Sekundärinfektion durch Pilze. Weitere Ansätze beschäftigen sich mit der Haltbarkeit von Pflanzenfrüchten, wie die Verzögerung des Reifeprozesses bei der “Anti-Matsch-Tomate”.